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淺析熒光素酶檢測試劑盒實(shí)驗步驟

瀏覽次數:744發(fā)布日期:2022-06-23
  熒光素酶檢測試劑盒是生物體內催化熒光素或者脂肪醛氧化發(fā)光的一類(lèi)酶的總稱(chēng),可以從細菌、螢火蟲(chóng)、海星等生物中提取出來(lái)。熒光素酶的這種催化底物產(chǎn)生自發(fā)熒光的特性可以靈敏地檢測基因的表達。
 
  可分別催化各自的底物發(fā)出不同顏色的熒光,且兩種光吸收波長(cháng)不同,檢測互不干擾,因此可在同一個(gè)化學(xué)反應體系中同時(shí)使用,作為雙熒光素酶報告基因系統使用,已成為研究轉錄因子參與基因調控的有效手段,通過(guò)對啟動(dòng)子DNA片段的分析,驗證啟動(dòng)子結合元件的反式激活能力,探討轉錄因子在信號轉導中的分子機制。
 
  熒光素酶檢測試劑盒實(shí)驗步驟:
 ?。?)用生物信息學(xué)方法分析并預測啟動(dòng)子區可能的轉錄因子結合位點(diǎn)(若目標是檢測miRNA及其靶基因的靶向作用,則需要預測兩者結合位點(diǎn))。
 ?。?)設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動(dòng)子片段,將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒(如pGL3-basic)中。
 ?。?)篩選陽(yáng)性克隆,測序。擴增克隆并提純質(zhì)粒備用。
 ?。?)擴增轉錄因子質(zhì)粒,提純備用。同時(shí)準備相應的空載質(zhì)粒對照,提純備用。
 ?。?)培養293(或其它目的細胞),并接種于24孔板中,生長(cháng)10-24小時(shí)。
 ?。?)將報告基因質(zhì)粒與轉錄因子表達質(zhì)粒共轉染細胞。
 ?。?)質(zhì)粒共轉染48h后,棄去培養基,用100μl1XPBS洗1遍。
 ?。?)傾斜96孔板,吸干剩余的PBS。
 ?。?)去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB,使用前放到常溫。
 ?。?0)每孔加50μl稀釋好的1XPLB,搖床常溫條件下?lián)u15min,進(jìn)行裂解。
 ?。?1)白色不透光的96孔酶標板中每孔加步驟(10)的上清液10μl,加入100μl預先混好的LARII,2s后測數據。
 ?。?2)每孔添加100μl預先混好的Stop&GloReagent,靜止2s后,測數據。
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